Ретровирусы (от англ. reversetranscriptase– обратная транскриптаза – фермент, входящий в состав вириона ретровирусов) были выделены в отдельное семейство в 1974 г.
Все представители семейства имеют следующие общие признаки: наличие липидной оболочки и сердцевины ( core ), характерную морфологию, наличие обратной транскриптазы (РНК-зависимой ДНК-полимеразы) внутри вириона, геном в виде односпиральной линейной РНК, которая образует комплекс, состоящий из двух идентичных субъединиц (около 3 МД каждая), репликация происходит через стадию образования двуспиральных ДНК провируса, интеграция ДНК провируса с клеточным геномом, осуществление транскрипции клеточной РНК-полимеразой, созревание вирионов путем почкования на клеточных мембранах.
В семействе Retroviridae выделяют 3 подсемейства: Oncovirinae, Spumavirinae, Lentivirinae.
1. Подсемейство Oncovirinae объединяет возбудителей ряда неопластических заболеваний животных. Различают 3 рода: OncovirusC, B, D.Представители подсемейства вызывают лейкоз кошек ( FLV ), лейкоз и саркому птиц ( ALSV ), ретикулоэндотелиоз птиц ( REV ), лейкоз крупного рогатого скота ( BLV ).
2. Подсемейство Spumavirinae включает «пенящие», синцитиальные вирусы.
3. ПодсемействоLentivirinae включает «медленные» ретровирусы (вирусы висны-маеди).
3.1. ЛЕЙКЕМИЯ КОШЕК
Feline leukaemia
Лейкоз кошек (лимфатическая лейкемия, лимфосаркома)- хронически протекающая болезнь, характеризующаяся анемией, перитонитом, гломерулонефритом, фибросаркомой и поражением молочной железы.
3.1.1. Клинические признаки и патологоанатомические изменения
Вирус вызывает у кошек лейкоз, анемию, гломерулонефрит, остеосклероз и иммунодепрессивный синдром. Различают эритроидный, миелоидный и лимфоидный лейкоз. Лимфоидный лейкозможет быть 4-х типов: вилочковый, полицентрический, алиментарный и подлинная лейкемия. Наиболее распространены тимусная лимфосаркома и лимфатическая лейкемия.
Кроме того, вирус вызывает ретикулосаркому и гранулоэритромонозную лейкемию, а в некоторых случаях аутоиммунный гломерулонефрит, некоторые формы анемии, инфекционный перитонит, гломерулонефрит, фибросаркому и, возможно, карциному молочной железы. Считают, что FeLV вызывает атрофию вилочковой железы и истощение лимфоидной системы, что приводит к нарушениям иммунологической компетентности. По чувствительности к FeLV кошки могут быть разделены на 6 классов. Горизонтальная передача FeLV может происходить либо эпигенетически, либо путём контакта.
3.1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ
Возбудитель лейкоза кошек – онкогенный онковирус. Широко распространен в популяции кошек и может передаваться горизонтально. Ранее предполагалось, что, поражая гематолимфоретикулярные клетки, он часто вызывает кошачью форму СПИДа.
Онковирусы кошек можно разделить на эндогенные и экзогенные. Эндогенные вирусы (ССС и МЭИ 4)выделяются из клеток либо спонтанно, либо под действием различных индукторов передаются вертикально, неонкогенны, сенотропны. Они могут размножаться в клетках человека и приматов, не способны размножаться в клетках кошек. В геноме нормальных клеток содержится более 100 копий генома этих вирусов. По данным молекулярной гибридизации, вирусы RD 114 и ССС очень сходны.
Экзогенные онковирусы (FeLVи FeSV)способны репродуцироваться в клетках хозяина (экотропны), передаются горизонтально, высокоонкогенны. Вирус FeSV вызывает злокачественную трансформацию фибробластов, приводящую к фибросаркоме кожи, а вирус FeLV трансформирует лимфоретикулярные клетки, что приводит к образованию лимфосарком и сарком ретикулярных клеток, вызывает инфицирование гемопоэтических клеток и, следовательно, может быть ответственен не только за другие формы лейкозов, но и за проявление некоторых онкогенных заболеваний.
Основной белок оболочки вируса FeLV представлен полипептидом с мол. м. 68кД, а оболочки вируса RD 114 — 77кД. В геноме клеток домашних кошек содержатся нуклеоидные последовательности, родственные 2-м вирусам С-типа — эндогенному вирусу RD 114 и экзогенному вирусу лейкоза FeLV. Геном клеток леопардовых кошек не содержит этих последовательностей.
Большинство взрослых кошек инфицированы экзогенными вирусами. Однако относительно низкий процент заболеваемости можно объяснить или развитием у кошек иммунитета в результате постоянной реинфекции малыми дозами вируса, или гибелью их от незлокачественных болезней, частота которых повышается за счёт вирусной иммунодепрессии. По gs-АГ эндогенные и экзогенные вирусы типа С кошек отличны друг от друга.
Морфология и химический состав. В 1964 г. Джаретт с сотр., заражая бесклеточным экстрактом котят, выделил вирус лейкоза кошек. Каваками с сотр. (1967), Рикард с сотр. (1968) и др. подтвердили эти данные. Харди с сотр. (1967) обнаружили вирус лейкемии кошек с помощью иммунодиффузии.
При центрифугировании вируса FeLV выделено 3 компонента — 755; 355 и 45, плотность в градиенте сахарозы 1,13-1,17 г/см 3. Выявлено 10 полипептидов ( VP 1-V P 10) с различной мол.м., процентным содержанием и локализацией в вирионе. По мол.м. АГ вируса лейкемии кошек разделены на 4 класса: 50, 30, 15 и 12кД. В структуре вируса различают белки, связанные с сердцевиной (р10, р12, р15 и р27), и 2 оболочечных белка — гликозилированный 70 кД (gр70) и негликозилированный 15 кД (р15). Гликопротеин gр70 содержит единственный нейтрализующий эпитоп.
Антигенная структура. Вирус лейкемии кошек (ВЛК) существует в 2-х формах: 1-й – «вирус в себе», индуцируемый метилколантрином из клеток здоровых кошек, не культивирующийся из пассажа в пассаж (эндогенный, спонтанный вирус), и 2-ой — инфекционный агент, передаваемый от кошки к кошке. ВЛК подгрупп А, В и С различают по структуре главного гликопротеина оболочки gр70. F eLV содержит 2 групповых специфических эфироустойчивых АГ (gs), общеспецифический внутренний g s -1, и межвидовой gs-3, характерный для частиц С-вирионов мышей, хомяков, кошек, крыс.
ВЛК содержит белки, сходные с белками вируса лейкемии мышей. Однако, в отличается от последних в данном вирусе АГ gs-1 обнаружен только у одного белка (14кД), а не у 3-х. Межвирионный АГ gs-3 найден в вирусах лейкемии кошек и лейкемии мышей во фракции белка с мол.м. 34кД gs-АГ. Определяют его в РСК, РДП, ИФ.
Антигенная активность. Показана прямая зависимость между уровнем гуморальных АТ и выраженностью противоопухолевой резистентности, на основе чего делаются попытки создания эффективной вакцины против вируса FeLV.
Иммунный статус кошек определяют по уровню АТ в крови. В качестве АГ для обнаружения АТ служат вирус-ассоциированные АГ клеточных мембран (СSА-АГ). Резистентность кошек к ВЛК зависит, по-видимому, от количества циркулирующих АТ к вирусу FeLV. Кошки с титром АТ 1:32 и выше могут не проявить признаков болезни, но выделяют вирус. У клинически больных кошек АТ, как правило, не выявляются. Примерно 90% клинически здоровых кошек не имеют защитного титра АТ к вирусу FeLV и поэтому подвержены инфекции. АТ тестируются в непрямой реакции ИФ и розеткообразования. ВНА к гликопротеину gp70 контролируют латентное инфицирование ВЛК, вызывая его элиминацию из организма кошек.
Антигенная вариабельность и родство. В 1969 г. был открыт вирус кошачьей саркомы ( FeLV ), близкородственный к ВЛК.
Экспериментальная инфекция. Изолированным вирусом лейкемии сравнительно легко воспроизвести лейкемию у котят (инкубационный период от нескольких недель до года). Для заражения вирус концентрируют. От больного котёнка вирус можно изолировать и воспроизвести экспериментальное заболевание у следующего животного. Патологические изменения характеризуются атрофией тимуса и других лимфоидных тканей. У некоторых кошек обнаруживают интеркуррентные инфекции. Развивающаяся лимфоидная малигнизация, так же как и атрофия тимуса, приводит животных к гибели либо с признаками лимфатической лейкемии, либо лимфосаркомы. У животного, заражённого вирусом лейкемии, можно наблюдать различные состояния клеток: клетки морфологически выглядят нормальными и не содержат вируса (1-й вариант), клетки трансформируются, но не содержат вируса (2-й вариант); клетки морфологически выглядят нормально, но содержат вирус (3-й вариант), клетки морфологически представляются трансформативными, содержат и выделяют вирус (4-й вариант). При лейкемиях чаще встречается 3-й вариант, при саркоме — 4-й. Если же вирус лейкемии кошек инокулировать другим животным, можно наблюдать 2-й вариант. FeLV и FeLS онкогенны не только для кошек, но и для животных других видов, включая собак и нескольких видов приматов.
Вирусоносительство и вирусовыделение. Вирус первоначально попадает в кровь, оттуда в костный мозг, где происходит его репродукция, затем вновь переходит в кровь, что сопровождается персистентной виремией. У здоровых кошек АГ FeLV обнаруживают только в 0,-14% случаев, а у лейкозных — в 90% случаев, Многие кошки могут быть заражены FeLV, но не болеть лейкемией.
Культивирование. Вирус лейкемии кошек (FeLV) развивается в культуре клеток фибробластов эмбриона кошек без видимых морфологических изменений. Выявить этот вирус можно методом смешанных культур, используя в качестве «культуры партнёра» линию клеток ХС, полученную из опухоли крысы, индуцированной вирусом саркомы птиц. Предварительно частично повреждают заражённый клеточный монослой, на который затем засевают индикаторные клетки ХС. Через 48 ч в зоне дефекта монослоя из индикаторных клеток образуются многочисленные гигантские многоядерные клетки. Кроме того, установлено, что FeLV способен размножаться в культуре клеток человека и собаки. Линия клеток Р274, полученная от кошки с Т-клеточным лейкозом, продуцирует подтипы А, В и С ВЛК и комплекс вирусного АГ, ассоциированного с мембранами клеток.
Особенности внутриклеточной репродукции. В чувствительные клетки вирус проникает путём пиноцитоза или прямого проникновения. Вирус лейкемии кошек — первый лейкозный вирус-«помощник», который преодолевает видовые барьеры. Он способен одевать в свою оболочку дефектный, т.е. неспособный самостоятельно заканчивать полный цикл размножения вирус мышиной саркомы, тем самым, обеспечивая ему проявление трансформирующего (онкогенного) действия в культуре клеток эмбриона кошек. Полученный таким образом гибрид, т.е. вирус, состоящий из генома (нуклеиновой кислоты) вируса мышиной саркомы и оболочки вируса лейкоза кошек, трансформировал клетки эмбриона кошек и не трансформировал клетки культуры эмбриона мышей.
3.1.3. ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Источники и пути передачи инфекции. Установлена чрезвычайно высокая распространённость и способность к горизонтальной передаче вируса FeLV, сближающая его с обычными инфекционными вирусами. Поэтому вирус может передаваться от кошки к кошке контактно и аэрогенно (горизонтальный путь передачи), реr os, через мочу, а также возможна передача блохами. Он находится не только в клетках гемопоэтической системы, но и в слизистых оболочках респираторных путей и ЖКТ и выделяется с мочой.
В отличие от вируса лейкоза мышей, ВЛК не передаётся вертикально потомству. Поэтому вследствие широко распространённого латентного вирусоносительства такие кошки могут служить источником заражения для контактирующих с ними здоровых особей.
3.1.4. ДИАГНОСТИКА
Вирус лейкемии кошек (ВЛК, FeLV) обнаруживается с помощью двух методов: ИФ и прямым выделением из плазмы.
Группоспецифический АГ gs-1 вируса FeLV можно выявить в лейкоцитах периферической крови методом непрямой ИФ. С этой целью используют кровь и мозг исследуемых кошек. Метод позволяет выявить заражённость кошек ВЛК в 90% случаев. В США используют метод определения АГ ВЛК в лейкоцитах периферической крови. Инфекцию можно диагностировать методом ЭМ. Вирус изолируют из лейкемийных клеток, плазмы, костного мозга и выращивают в культуре клеток кошки, собаки и человека.
3.1.5. ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА
Иммунитет не изучен, однако доказана возможность вакцинации кошек против лейкемии, на основании чего в США создана эффективная вакцина. Доказана возможность латентного инфицирования ВЛК без развития лейкоза у кошек, но с формированием выраженного иммунитета, что явилось основанием к разработке средств специфической профилактики. Разработана рекомбинантная субъединичная вакцина против лейкоза кошек. В качестве АГ использовали негликозилированный гликопротеин оболочки ВЛК подгруппы А. Такой рекомбинантный белок включал белок оболочки (gp70) и первые 34 аминокислоты трансмембранного белка р15Е. Вакцина представляет собой очищенный белок, адсорбированный на ГОА, и содержит сапонин. У вакцинированных кошек образуются ВНА и развивается реакция на введение ВЛК: иммунизированные животные были защищены от вирусной инфекции. Помимо этого, для изготовления инактивированной формолвакцины использовали шт. КТ-FeLV-UCD-1, репродуцированный в линии клеток FL-74-UCD-1, на среде Лейбовица с 15-30% фетальной сыворотки КРС. Оптимальная концентрация формальдегида для инактивации вируса была равна 0,5-1,5%. Оптимальная протективная доза составляла 0,02-0,4 мг инактивированного белка вируса при внутримышечном введении. В качестве адъюванта используют неполный адъювант Фрейнда или ГОА. Вакцина предотвращала персистентную инфекцию.
Вакцинация кошек с последующей ревакцинацией через 2 и 11 нед субъединичной вакциной, включающей АГ подтипов А, В и С и мембранный АГ онкорновируса кошек защищала животных от развития инфекции при последующем их заражении вирулентным штаммом ВЛК. Она хорошо защищала кошек от персистентной инфекции и возникновения опухолей. Живая рекомбинатная вакцина оказалась безопасной и эффективной. У половины вакцинированных котят вакцинный вирус обнаружен в костном мозге со 2-й по 4-ю нед, но отсутствовал в периферической крови и не выделялся со слюной, мочой и калом. Он не передавался горизонтально невакцинированным котятам. Вакцина, приготовленная из клеток РЬ74, обработанных формалином, защищала котят от виремии и образования опухолей.
Вакцинация кошек оболочечными гликопротеинами ВЛК ( g р70/85) сопровождалась образованием АТ, выявляемых в ИФА, но не в РН. При заражении вакцинированных котят ВЛК наблюдали персистентную инфекцию. Вакцинация кошек с последующей ревакцинацией через 2 и 11 нед субъединичной вакциной против ВЛК (gp70/85), включающей АГ подтипов А, В и С ВЛК, а также мембранный АГ (РА5МА) онковируса кошек также защищала животных от персистентной виремии и развития опухолей. В настоящее время не оставлены попытки создать генно-инженерную вакцину для профилактики лейкоза кошек. С этой целью гены nv и gag ВЛК экспрессировали в герпесвирусе кошек, неактивном по тимидинкиназе, и в бакуловирусе. Предложена схема вакцинации этими рекомбинантами, приводящая к 100% защите кошек от вирусной лейкемии.