Анализ антигенных и иммуногенных свойств искусственных коллагеновых материалов, применяемых в медицинской и ветеринарной практике


А. И. САПОЖНИКОВА

Препараты из коллагена, в частности коллагеновые губки, в настоящее время широко применяются в ветеринарной и медицинской практике. По мнению ряда исследователей (Шехтер А.Б.; Хилькин А.М.), они мало антигенны и практически безвредны для живого организма. Однако методический уровень проведенных ис следований недостаточен для подобного рода заключений.

Цель настоящей работы — выяснить степень антигенности и иммуногенности искусственных фибриллярно-пористых ма териалов (губок), получаемых на основе продуктов раство­ рения коллагена (ПРК), по сравнению с ПРК, с помощью разработанной нами диагностической тест-системы для об наружения антител к коллагену в реакции энзиммеченных антител.

Экстракты из коллагеновых губок, предназначенные для использования в иммунохимических исследованиях в качестве антигена, получали следующим образом. Губку разрезали на мелкие кусочки, заливали буферными растворами с рН 7,2; 9,6; 13,0 в соотношении 20 мл буферного на 6 г губки и выдерживали в течение суток при +4° С. Для получения экстрактов «кашицу» из губки подвергали обработке на ультразвуковом дезинтеграторе; гомогенат осветляли центрифугированием при 8 тыс. об/мин.

Содержание белка в надосадочных жидкостях (экстрак тах) определяли методом Лоури. Антисыворотки по лучали иммунизацией 5 кроликов-самцов породы шиншилла . Реакцию ставили на планшетах для иммунологиче ских реакций. Пред варительно исследуемые антигены (экстракты из коллагено вых губок и ПРК) стандартизовали по белку, разводя их буфером с рН 13,0 таким образом, чтобы концентрация бел ка была равна 20 мкг/мл. В качестве контроля использовали раствор нейтрального белка (бычьего сывороточного альбу мина — БСА) в том же буфере и в концентрации, соответ ствующей концентрации антигена.

При сенсибилизации полистироловой планшеты, т. е. для адсорбции антигенов па внутренней поверхности лунок в нечетные вертикальные ряды ее вносили исследуемый антиген, четные были контрольными. Объем вносимого в каждую лунку белка 0,2 мл. Антигены на носитель (полистирол) наслаи вали в течение 1 ч при +37°.

По окончании сенсибилизации планшету тщательно про мывали водопроводной водой и 0,05%-ным раствором детер гента твин-20 для удаления несвязавшихся с полистиролом белков. Так как мы использовали РЭМА для определения конечных титров полученных от кроликов гипериммунных сывороток, то каждую антисыворотку титровали вне планше ты кратно 2 от начального разведения 1:50 до 1:6400, ис пользуя в качестве жидкости для разведения фосфатно-соле вой буфер с рН 7,2 с твин-20. Каждое разведение антисыво ротки заливали в соответствующий горизонтальный ряд планшеты так, чтобы в лунки с адсорбированными на их внутренней поверхности антигеном и его контролем, нахо дящимся на пересечении вертикальных нечетного и четного рядов и данного горизонтального ряда, было внесено одно и то же разведение антисыворотки в объеме 0,2 мл в каж дую лунку. Планшету с сывороткой инкубировали при +37° в течение часа. После отмывки во все лунки плашки зали пали по 0,2 мг антикроличьего иммуноглобулина, меченного пероксидазой из хрена (конъюгата), в рабочем разведении 1:400. . После инкубирования в течение 1 ч при +37° несвязавшийся конъюгат удаляла при промывке планшеты проточной водой с 0,05%-ным твин-20 и в лунки вносили субстратную смесь (5-аминосали- циловую кислоту и перекись водорода). Реакцию учитывали через 2 ч визуально по разведению сыворотки путем сравне ния окраски с контролем.

Наши опыты по определению содержания белка в экст рактах, полученных из коллагеновых губок при обработке их буферными растворами с рН 7,2; 9,6; 13,0, свидетельствуют о переходе некоторого количества белка из губки в раствор при экстракции и о возрастании концентрации белка в экст рактах с увеличением рН экстрагирующего буфера (150; 180 и 240 мкг/мл соответственно).

Результаты поиска антигенов, идентичных ПРК, в экст рактах коллагеновых губок с помощью пула (смеси) моно специфических гипериммунных сывороток к ПРК подтверди­ли нашу рабочую гипотезу о присутствии в экстрактах ан тигенных компонентов, общих с таковыми в ПРК. Так, при сравнительном анализе ПРК и экстрактов в реакции энзим- меченных антител положительную реакцию в тест-системе мы наблюдали при разведении пула антисывороток к ПРК 1 :1600, а в экстрактах, полученных при рН 7,2; 9,6; 13,0 при разведении — 1:25; 1:25 и 1:50 соответственно.

Если рассматривать тест-систему как эталон антигенно сти коллагена, то можно считать, что в растворимом компо ненте искусственных коллагеновых материалов (ИКМ) со храняется от 1,5 до 3,0% антигенной активности ПРК. Тем не менее, такой незначительной антигенности было доста точно, чтобы вызвать иммунный ответ к экстрактам из ИКМ.

В реакции энзим-меченных антител при сенсибилизации полистироловых планшет ПРК нам удалось показать присутствие антител к экстрактам коллагеновых губок в индивиду альных кроличьих сыворотках, хотя и в относительно низ ких концентрациях. При сенсибилизации планшеты экстрак тами из губок присутствие антител не было зарегистриро вано.

Полученные результаты еще раз подтверждают данные о крайне низкой антигенности ИКМ по сравнению с ПРК. Од нако активная иммунизация ИКМ может привести к накоп лению в организме количества антигена, способного индуци­ ровать синтез антител к ним. Что касается уровня антител в исследованных сыворотках, то его, несомненно, можно по высить при повторных реиммунизациях.

ВЫВОДЫ

  • Установлено, что с помощью буферных растворов можно экстрагировать из коллагеновой губки некоторое количест во белка, причем увеличение рН экстрагирующего буфера ве дет к возрастанию концентрации белка в экстракте.
  • С помощью разработанной ранее диагностической тест- системы для обнаружения антител к ПРК показано, что в экстрактах коллагеновых губок имеются антигенные компо ненты, идентичные с таковыми в ПРК.
  • Установлено, что в губке сохраняется от 1,5 до 3,0% антигенной активности ПРК.
  • Проведена интенсивная иммунизация кроликов растворимым компонентом (экстрактами) коллагеновых губок, по лучены гипериммунные сыворотки, в которых проведен коли чественный учет специфических антител к экстрактам колла геновых губок.

Оставить комментарий

avatar
Photo and Image Files
 
 
 
Audio and Video Files
 
 
 
Other File Types
 
 
 
  Подписаться  
Уведомление о