Все реакции жизнеобеспечения, происходящие в микробной клетке и катализируемые ферментами, составляют обмен веществ, или метаболизм. Промежуточные или конечные продукты, образующиеся в соответствующей последовательности ферментативных реакций, в результате которых разрушается или синтезируется ковалентно связанный скелет конкретной биомолекулы, называют метаболитами.
В метаболизме микроорганизмов непрерывно осуществляются два противоположных и вместе с тем единых процесса: анаболизм и катаболизм. Другими словами, обмен конструктивный и энергетический. В первом случае обмен веществ протекает с поглощением свободной энергии при расходовании сравнительно небольшого объема питательного материала, во втором — идет процесс выделения свободной энергии, на что расходуется огромная масса питательного субстрата.
По типу питания живые существа делятся на две группы: голозойные и голофитные. Голозойный тип питания характерен для животных (от высших до простейших). Микробы относятся к голофитному типу питания. Они не имеют органов для принятия пищи, и питательные вещества у них проникают через всю поверхность тела.
Различают несколько механизмов питания микробных клеток. Питательные вещества могут поступать из внешней среды в микробную клетку через клеточную стенку, капсулу, слизистые слои и цитоплазматическую мембрану. Через эти же структуры выделяются и продукты обмена, т. е. ненужные и вредные для микроорганизмов вещества. В основе механизма такого питания лежит осмотическое явление, основанное на разнице концентрации питательных веществ в теле микроба и питательном растворе. Таким образом вода и растворенные в ней питательные вещества поступают в микробную клетку. В результате биосинтеза в ней накапливается пластический материал коллоидной структуры (белки, углеводы и др. вещества), обусловливающий рост и размножение микроорганизма.
Проникновение питательных веществ в клетку может осуществляться с помощью диффузии и стереохимического специфического переноса питательных веществ. Каждый из этих процессов может протекать как активно, так и пассивно. При пассивной диффузии питательные вещества проникают с током жидкости в клетку и только тогда, когда проникаемое вещество способно растворяться в клеточной стенке бактериальной клетки. При активной диффузии наблюдается проникновение питательных веществ в бактериальную клетку нерастворенными в клеточной стенке.
При стереохимическом переносе питательных веществ (из внешней среды в клетку) роль переносчика выполняет пермеаза — белковый компонент. В этот период питательные вещества среды активно транспортируются в клетку, осуществляя конструктивный и энергетический обмены.
В норме у бактериальных клеток всегда наблюдается определенное напряжение цитоплазмы. Это объясняется тем, что коллоиды цитоплазмы благодаря постоянному притоку к клетке воды находятся в набухшем состоянии, в результате чего цитоплазма бывает плотно прижата к оболочке. Такое явление получило название тургора бактерийной клетки. Тургор определяет постоянство бактерий. Величина осмотического давления у бактерий при этом не превышает 6х10 Па. Но есть микробы, обитающие в морях и океанах, у которых осмотическое давление достигает порядка 9х10 Па.
Когда бактерии помещают в раствор, содержащий 15—20 % хлорида натрия или сахара (гипертонический раствор), наступает резкое обезвоживание бактерийной клетки и протоплазматическое содержимое ее отходит от оболочки. Такое явление носит название плазмолиза.
Морфологически плазмолиз характеризуется возникновением шарообразных светопреломляющих образований в теле клетки. У различных микроорганизмов плазмолиз проявляется не в одинаковой степени. К нему особенно устойчивы сенная бацилла, стафилококки, сардины; легко подвергаются плазмолизу бактерии из группы пастерелл, эшерихий, сибиреязвенная бацилла, холерный вибрион и др.
Противоположный плазмолизу процесс — плазмоптиз — наблюдается в том случае, если бактерии поместить в гипотонический раствор хлорида натрия или в дистиллированную воду. Вода проникает при этом в бактерийную клетку, цитоплазматическое вещество ее разбухает до крайних пределов, и клетка приобретает форму шара. Плазмоптиз, так же как и плазмолиз, влечет за собой гибель бактерийной клетки.
Типы питания микробов. Различают углеродное и азотное питание микроорганизмов. По типу углеродного питания микробы принято делить на аутотрофы и гетеротрофы.
Аутотрофы, или прототрофы, (греч. autos — сам, trophe — пища) — микроорганизмы, способные воспринимать углерод из угольной кислоты (СО2) воздуха. К ним относят нитрифицирующие бактерии, железобактерии, серобактерии и др. Аутотрофы превращают воспринятую углекислоту в сложные органические соединения путем хемосинтеза, т. е. путем окисления химических соединений (аммиак, нитриты, сероводород и др.). Таким образом, аутотрофные микробы обладают способностью создавать органические вещества из неорганических, таких как угольная кислота, аммиак, нитриты, сероводород и др. Поскольку такие микробы не нуждаются в органических соединениях углерода, входящего в состав животных и человека, они не являются болезнетворными. Однако среди аутотрофов встречаются микробы, обладающие способностью усваивать углерод из СО2 воздуха и из органических соединений. Такие микробы определены как миксотрофы (миксо — смесь, т. с. смешанный тип питания). Отдельные виды аутотрофных микробов питание осуществляют подобно зеленым растениям за счет фотосинтеза. Так, пурпурные серобактерии вырабатывают особый пигмент типа хлорофилла — бактериопурпурин, при помощи которого и происходит использование световой энергии (фотосинтез) для построения органических веществ своего тела из угольной кислоты и неорганических солей.
Гетеротрофы (heteros — другой) в противоположность аутотрофным микробам получают углерод главным образом из готовых органических соединений. Гетеротрофы — возбудители различного рода брожений, гнилостные микробы, а также все болезнетворные микроорганизмы: возбудители туберкулеза, бруцеллеза, листсриоза, сальмонеллеза, гноеродные микроорганизмы — стафилококки, стрептококки, диплококки и ряд других патогенных для животного организма возбудителей.
Однако все физиологическое многообразие микроорганизмов не укладывается в узкое понятие об аутотрофах и гетеротрофах. В действительности же при изменении условий среды (например, питания) обмен веществ у микробов может меняться. Если микроб поместить в другую, необычную для него, питательную среду, то он начнет вырабатывать адаптивные (приспособительные) ферменты (энзимы). В качестве примера можно указать на азотфиксирующие бактерии (аутотрофы), которые на богатых белковых питательных средах перестают использовать молекулярный азот воздуха и начинают усваивать связанный азот (гетеротрофный тип усвоения азота).
Гетеротрофы включают в себя две подгруппы: метатрофных и паратрофных микроорганизмов. Метатрофы, или сапрофиты, живут за счет использования мертвых субстратов. Сапрофиты (sapros — гнилой, fhyton — растение) — гнилостные микробы. Паратрофы (греч. parasites — нахлебник) паразиты, живущие на поверхности или внутри организма хозяина и питающиеся за его счет.
В качестве источника углерода гетеротрофы чаще всего используют углеводы, спирты, различные органические кислоты. Наиболее полноценными источниками углерода для питания этих микробов являются сахара (особенно гексозы), многоатомные спирты (глицерин, маннит, сорбит и др.), а также карбоновые кислоты (например, глюкуроновая) и оксикислоты (молочная, яблочная и др.). Все эти источники углерода обычно и включают в состав искусственных питательных сред для выращивания микроорганизмов.
Основным источником азотного питания у аутотрофов являются неорганические соединения азота, т. е. соли азота. У гетеротрофных микроорганизмов — аминокислоты, которые они используют из белков животного организма, если в нем паразитируют, или получают их готовыми из питательных сред.
По способу усвоения азотистых веществ микробы делят на четыре группы:
1) протеолитические, способные расщеплять нативные белки, пептиды и аминокислоты;
2) дезаминирующие, способные разлагать только отдельные аминокислоты, но не белковые вещества;
3) нитритно-нитратные, усваивающие окисленные формы азота;
4) азотфиксирующие, обладающие свойством питаться атмосферным азотом.
В качестве универсального источника азота и углерода в питательных средах для патогенных микробов применяют пептоны. Потребность микроорганизмов в зольных элементах незначительна. Необходимые для их жизни минеральные соли (сера, фосфор и др.) почти всегда имеются в естественной питательной среде. Сера воспринимается бактериями в основном из сульфатов или органических соединений аминокислот (цистин, цистеин). Серобактерии, например, могут сами ассимилировать даже молекулярную среду. В их теле находится до 80 % серы. Фосфор входит в состав нуклеопротеидов и фосфолипидов бактерийной клетки и играет весьма важную роль в ее биосинтетических процессах. Источником питания фосфором являются различные фосфорнокислые соли, например тринатрийфосфат (ЫазРО4).
Жизненно необходимые элементы — калий, магний и железо — микроорганизмы получают из различных солей. Железо входит в состав гемина (особая органическая группа цитоплазмы) и служит катализатором окислительных реакций. Калий — обязательный элемент в питательной среде, но физиологическое значение его еще полностью не выяснено. Роль кальция в жизни бактерий (за исключением бактерий, участвующих в фиксации азота из воздуха), по-видимому, невелика. Магний активирует различные ферменты бактерий, в частности протеазу. Микроэлементы бор, цинк, марганец, кобальт и др. встречаются в бактериях в ничтожных количествах и служат стимуляторами роста микробов.
Факторы роста микробов. В 1901 г. Вильдье в дрожжах нашел особое вещество, названное им «биос» — ростовое вещество. В 1904 г. наш соотечественник Никитинский установил такие же стимуляторы роста в культурах плесневых грибов. В дальнейшем подобные вещества были выявлены у патогенных микроорганизмов и простейших. Одновременно было установлено, что у ряда микробов под воздействием ничтожно малых количеств ростовых веществ увеличивается накопление микробной массы и изменяется обмен веществ. Новейшие данные показали, что по химической структуре и физиологическому действию стимуляторы являются подлинными витаминами или витаминоподобными веществами.
Все изученные бактерии нуждаются в витаминах или ростовых веществах, которые играют главным образом роль катализаторов (ускорителей) биохимических процессов бактерийной клетки. Они же являются структурными единицами при образовании некоторых ферментов. Какие же витамины необходимы микробам? К витаминам, необходимым для развития микробов, относят биотип (витамин Н), витамины группы В: витамин B1 (тиамин), В2 (рибофлавин), В3 (пантотеновая кислота), В4 (холин), В5 (никотинамид), Вб (пиридоксин), В7 (гемин), — витамин К и др.
Концентрация витаминов в питательной среде выражается в микрограммах (мкг), потребность в них колеблется в пределах 0,05—40 мкг/мл. Избыток витаминов задерживает рост бактерий.
Кроме витаминов, к факторам роста бактерий относятся пуриновые и пиримидиновыс основания и их производные (аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин). Например, для гемолитического стрептококка фактором роста является аденин, для золотистого стафилококка — урацил, возбудителя столбняка — аденин или гипоксантин.
Некоторые микроорганизмы в качестве фактора роста используют аминокислоты, синтезирующиеся самой микробной клеткой или находящиеся в среде в готовом виде.
ДЫХАНИЕ
Дыхание микробов — это биологический процесс, сопровождаемый окислением или восстановлением различных, преимущественно органических, соединений с последующим выделением энергии в виде аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), необходимой микробам для физиологических нужд.
Процесс, в котором атомы или молекулы теряют электроны (е~), называется окислением, а обратный процесс — присоединение электронов — восстановлением. Этот процесс можно продемонстрировать примером превращения частично окисленного двухвалентного железа в полностью окисленное трехвалентное железо и обратно по схеме
Перенос электрона всегда сопровождается высвобождением энергии, которая немедленно утилизируется клеткой с помощью аденозиндифосфата (АДФ) и аденозинтрифосфата (АТФ). Здесь она накапливается и расходуется по мере надобности микробной клеткой на ее нужды.
Переносчиками водорода в реакциях биологического окисления и восстановления являются главным образом два пиридиновых нуклеотида (коферменты анаэробных дегидрогеназ) — никотина-мидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидадениндинуклеотид-фосфат (НАДФ). Отнимая водород от окисляемого субстрата, они переходят в восстановительную форму (НАД*Нг и НАДФ#Нг) и переносят водород на другой акцептор. НАД*Н2 передает водород главным образом на промежуточные продукты брожения или в дыхательную цепь, а НАДФ’Нг участвует преимущественно в реакциях биосинтеза различных веществ, которые входят в состав клетки микроорганизма.
Типы биологического окисления. С биохимической точки зрения окисление биологического субстрата микроорганизмами может быть достигнуто по типу прямого окисления и непрямого окисления, или дегидрогенирования.
Прямое окисление осуществляется с помощью оксидаз путем непосредственного окисления вещества кислородом воздуха или же путем дегидрирования — отнятия от субстрата водорода, точнее, его электрона. Прямое окисление регистрируется у большинства сапрофитных микроорганизмов. Например, Bact. raetanicum, окисляя метан, получает энергию по следующей схеме:
СН4 + 2О2 — СО2 + 2Н2О + 946 кДж энергии.
У некоторых микробов, поглощающих кислород, реакции окисления не доходят до получения конечного продукта, т.е. до образования углекислоты. Примером такого неполного окислительного процесса может служить дыхание уксуснокислых бактерий, у которых конечным продуктом окисления этилового спирта является не углекислота, а уксусная кислота:
СН3СН2ОН + О2 — СНзСООН + Н2О.
Непрямое окисление путем дегидрогенирования сопровождается одновременным переносом двух электронов, причем от субстрата отщепляются два протона (Н). При ферментативном отщеплении водорода субстрата при помощи дегидрогеназ освобождаются два электрона (энергия) подобно образованию ацетальдегида из этилового спирта.
Дегидрогеназ у бактерий несколько, они называются по донору водорода (например, алкогольдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа), но большинство их переносит водород на один из двух коферментов — никотинамидадениндинуклеотид (НАД ) или никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ+). Оба кофермента легко отделяются от одной дегидрогеназы и связываются с другой дегидрогеназой, переносят водород на другой акцептор. НАД»Н(+Н ) переносит водород преимущественно на предшественники брожения или в дыхательную цепь; НАДФ»Н (+Н+) участвует в основном в биосинтезе.
Аэробное дегидрогенирование происходит в присутствии кислорода, и у таких микробов как, например, бациллы, акцептором водорода является кислород, в результате чего в зависимости от набора ферментов образуется вода или перекись водорода. Для этого у аэробных бактерий имеются цитохромоксидаза и система геминовых ферментов-цитохромов. Облигатные анаэробы каталазу не содержат, чем частично можно объяснить токсичность для них кислорода.
Анаэробное дегидрогенирование осуществляется в отсутствие молекулярного кислорода. Акцепторами водорода в данном случае являются другие неорганические элементы, например, соли азотной, серной кислот, углекислоты, которые превращаются при этом в более восстановленные соединения (аммиак, метан, сероводород).
Свойство анаэробов переносить электроны на нитраты, сульфаты и карбонаты обеспечивает в достаточной степени полное окисление органического или неорганического вещества без использования молекулярного кислорода и обусловливает возможность получения ими большего количества энергии, чем при процессе брожения. При анаэробном дыхании выход энергии только на 10 % ниже, чем при аэробном. Микроорганизмы, для которых характерно анаэробное дыхание, имеют набор ферментов цепи переноса электронов, но цитохромоксидаза заменяется нитратредуктазой (в случае использования нитратов) или аденилилсульфатредуктазой (в случае использования сульфатов).
Классификация микробов по типу дыхания. В 1861 г. Л. Пастер, изучая бродильные свойства микроорганизмов, обнаружил, что отдельные микробы способны размножаться без доступа атмосферного кислорода. Бактерии и грибы, использующие кислород из воздуха, получили название облигатных аэробов, а в условиях его отсутствия — анаэробов. У аэробов конечным акцептором электронов является молекулярный кислород, для анаэробов конечным акцептором электронов являются неорганические соединения, такие как нитраты, сульфаты, карбонаты.
По типу дыхания микроорганизмы классифицируют на четыре основные группы.
Облигатные (безусловные) аэробы растут при свободном доступе кислорода, обладают ферментами, позволяющими передать водород от окисляемого субстрата конечному акцептору — кислороду воздуха. К ним относятся уксуснокислые бактерии, возбудители туберкулеза, сибирской язвы и многие другие.
Микроаэрофильные бактерии развиваются при низкой (до 1 %) концентрации кислорода в окружающей атмосфере. Такие условия благоприятны для актиномицетов, лептоспир, бруцелл.
Факультативиые анаэробы вегетируются как при доступе кислорода воздуха, так и в отсутствие его. Имеют соответственно два набора ферментов. Это многочисленная группа микроорганизмов, к которой относятся, в частности, энтеробактерии, возбудитель рожи свиней.
Облигатные (безусловные) анаэробы развиваются при полном отсутствии кислорода в окружающей среде. Анаэробные условия необходимы маслянокислым бактериям, возбудителям столбняка, ботулизма, газовой гангрены, эмфизематозного карбункула, некробактериоза.
Окислительно-восстановительный потенциал питательной среды. При изготовлении питательных сред учитывают не только рН среды, но и соотношение веществ, отдающих и принимающих электроны. Величину окислительно-восстановительного потенциала обозначают символом гНг — отрицательный логарифм парциального давления газообразного водорода. Он измеряется потенциометром или на универсальном ионометре в mV и обозначается в единицах. Диапазон гН2 от 0 до 42,6 характеризует все степени насыщения раствора Н и Ог. Так, строгие анаэробы растут при низком окислительно-восстановительном потенциале — от 0 до 12 факультативные микроорганизмы — 0 до 20 и аэробы — от 14 до 35. Следовательно он минимальный при насыщении среды водородом и максимальный при насыщении кислородом. Регулируя степень окислительно-восстановительного потенциала, мы создаем благоприятные условия для роста и размножения микроорганизмов.
Методы создания анаэробиоза. Для выделения анаэробных возбудителей инфекционных болезней создаются анаэробные условия культивирования. Для этого существует несколько методов.
1. Физический метод. Он заключается в удалении воздуха из эксикатора или анаэростата при помощи масляного воздушного насоса. Жидкие среды перед засевом для удаления из них воздуха кипятят, т. е. проводят так называемое регенерирование среды; для предотвращения контакта жидкой среды с воздухом на ее поверхность наносят слой вазелинового или парафинового масла.
2. Химический метод. Основан на применении поглотителей кислорода, например, пирогаллола с гидроокисью натрия, калия либо гидросульфита натрия с натрия гидрокарбонатом в соотношении 1:1.
3. Биологический метод (метод Фортнера). Основан на выращивании анаэробов в присутствии аэробов (например, «чудесной палочки») в одной чашке Петри. Вначале вырастает аэробная культура, а затем по мере поглощения последней кислорода из чашки начинает развиваться анаэробная культура.
4. Комбинированный метод. Предусматривает использование двух других, скажем, физиологического и химического.
Нередко удается ослабить или полностью нейтрализовать вредное для бактерий действие кислорода прибавлением к среде восстановителей (аскорбиновой кислоты, тиогликолата, цистеина).